Corso: Applicazioni Biochimiche e Biotecnologiche

Introduzione

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Docente

Docente: dott.ssa Silvia Chichiarelli

Ricercatore SSD: BIO/10 - biochimica

Dip.to di Scienze Biochimiche "A. Rossi Fanelli" - II Piano - Stanza 202
Università "La Sapienza" - P.le A.Moro 5 - 00185 Roma

Struttura di afferenza:
	Dip.to Scienze Biochimiche "A. Rossi Fanelli"

Tel:	+39 0649910598	Email:	silvia.chichiarelli@uniroma1.it

Ricevimento studenti:

Lunedì ore 10-11
Giovedì ore 10-11
per appuntamento tramite e-mail

Informazioni Corso

Anno	4° anno
Tipologia	A scelta dello studente
Crediti/Valenza	8 CFU
Anno Accademico	2023/24
Periodo didattico	primo semestre

Denominazione Insegnamento	APPLICAZIONI BIOCHIMICHE e BIOTECNOLOGICHE
PROVA DI ESAME	Esame Orale

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Il principale obiettivo del corso di Applicazioni biochimiche e Biotecnologiche è quello di permettere allo studente uno studio più approfondito delle tecniche biochimiche, di biologia molecolare e biotecnologiche, per prepararlo all’utilizzo delle stesse tecniche nello sviluppo, in modo creativo ed inventivo, di nuove strategie di indagine, di nuovi approcci diagnostici e terapeutici per condizioni patologiche.

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PROGRAMMA

1° settimana
Principi generali delle metodologie biochimiche e di biologia molecolare.
Tecniche di base (Soluzioni tampone. Metodi di omogeneizzazione meccanici e non meccanici. Centrifugazione: ultracentrifuga preparativa ed analitica e loro applicazioni; velocità ed equilibrio di sedimentazione; centrifugazione su gradiente di densità; centrifugazione, zonale ed isopicnica. Dialisi e ultrafiltrazione. Cromatografia: scambio ionico (autoanalizzatore di amminoacidi); ad esclusione molecolare; di affinità. Spettroscopia: Spettrofotometria visibile ed UV: aspetti teorici, strumentazione ed applicazioni nella ricerca biochimica. Spettrofluorimetria. Cenni Radioisotopia)

2° settimana

Esempi di progettazione di un esperimento, consultazione della letteratura scientifica.
Modelli di sperimentazione biologica.
Colture cellulari: il laboratorio di colture di cellulari; metodi di coltura di cellule; medium di coltura; separazione ed analisi delle popolazioni di cellule; conteggio e conservazione; citometria a flusso, FACS e MACS. Applicazione di composti marcati in biologia. Tecniche di Purificazione delle proteine (es. purificazione mediante cromatografia per affinità: magnetic beads; Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC).

3° settimana

Elettroforesi: principi e fattori che regolano la migrazione di una biomolecola in un campo elettrico. Elettroforesi nativa; SDS-PAGE; Elettroforesi degli acidi nucleici. Isoelectrofocusing. 2D_SDS-PAGE. Elettroforesi capillare. Metodi di rivelazione colorimetrici ed immunologici di proteine analizzate mediante elettroforesi (Western Blotting).

4° settimana

L’immunochimica: principi della reazione antigene-anticorpo. Tecniche immunoenzimatiche (ELISA; EMIT; CEDIA): ELISA diretto, indiretto, sandwich. Utilizzo dell’Elisa per dosaggi quantitativi di Ag ed Ab in campioni biologici. Tecniche per lo studio del binding ligando-recettore.

5° settimana.

Tecniche di manipolazione del DNA e RNA: Estrazione degli acidi nucleici; Separazione elettroforetica del DNA ed RNA; Southern e Northen blotting (Tecniche di blotting);

6° settimana

Marcatura delle sonde di ibridizzazione; Electrophoretic mobility shift assay (EMSA); L’immunoprecipitazione (Co-IP; ChIP; X-ChIP); Microarrays.

7° settimana

Sintesi chimica e sequenziamento del DNA; Endonucleasi di restrizione; Vettori di clonaggio. Vettori di espressione in procarioti ed eucarioti. Produzione di proteine in procarioti ed eucarioti (esempi di proteine ricombinanti utilizzate in terapia).

8° settimana

PCR end-point; RT-PCR; RealTime PCR, Single-cell qRT-PCR; Mutagenesi in vivo ed in vitro; PCR nella mutagenesi sito specifica, in diagnostica e nella medicina personalizzata.

9° settimana

Produzione di Organismi geneticamente modificati (OGM; modelli murini per la clinica); MicroRNA; RNA interference e SiRNA (es. uso in terapia). Genome Editing (es. Crispr/CAS system) e applicazioni terapeutiche. Cenni su Cellule staminali.

10° settimana

Metodologie per la produzione di vaccini ricombinanti e Anticorpi umanizzati. Utilizzo di virus o anticorpi ricombinanti in terapia (es: anti-tumorali).

11° settimana

Principi di purificazione enzimatica e principali tecniche di dosaggio enzimatico. (Cinetica, regolazione e Inibizione enzimatica). Immobilizzazione enzimatica, Cinetica enzimi immobilizzati, Biosensori (es. in diagnostica).

12° settimana.

Enzimologia clinica: enzimi in diagnostica (enzimi strumenti di diagnosi); enzimopatie; enzimopatie genetiche e terapie sostitutive.

Testi adottati e bibliografia di riferimento

Bonaccorsi MC, Contestabile R, Di Salvo M "Metodologie biochimiche - Espressione, purificazione e caratterizzazione delle proteine" Seconda edizione - Zanichelli (2019) - ISBN: 9788808520586

Mauro Maccarrone "Metodologie biochimiche e biomolecolari - Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio" - Zanichelli (2019) - ISBN: 9788808520555

Nanette Pazdernik & David Clark, “Biotechnology” (2nd Edition) – Ed. Elsevier Science & Technology, Academic Cell; ISBN: 978-0-12-385015-7 (2015)

Benjamin E. Blass “Basic Principles of Drug Discovery and Development” – Ed. Academic Press; ISBN-10: 012411508X or ISBN-13: 978-0124115088 (2015)

Terry A. Brown "Biotecnologie molecolari" - Principi e tecniche Seconda edizione italiana condotta sulla settima edizione inglese Ed. Zanichelli. (2017) - [“Gene Cloning and DNA analysis: An introduction”, John Wiley & Sons - ISBN: 978-1-119-07256-0 (2016)]

Denise R Ferrier “Le basi della biochimica” Seconda edizione italiana condotta sulla sesta edizione americana (2014)

Dean R. Appling - Spencer J. Anthony-Cahill - Christopher K. Mathews “Biochimica - Molecole e metabolismo • Con Mastering Chemistry™” Ed. Pearson (2017)

Terry A. Brown “Conoscere la Biochimica “Trad. di N. Taddei e G. Maga - Ed. Zanichelli. (2018)

Materiale didattico fornito dal Docente. (Lectures notes/slides)

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Objectives

The aim of the Biochemical and Biotechnological Applications course is to allow the student an in-depth knowledge of biochemical and biotechnological techniques from both a theoretical and practical perspective. The final aim is to prepare him/her to make use of these techniques to develop, in a creative and inventive way, new investigation strategies as well as new diagnostic and therapeutic approaches to pathologies.

Course Description

1st week
Principles of Biochemistry and Molecular Biology.
Basic techniques (Mechanical and non-mechanical homogenization methods). Centrifugation: preparative and analytical ultracentrifuge; sedimentation speed and balance; centrifugation in density gradient; zonal and isopicnic centrifugation; dialysis and ultrafiltration. Affinity, Gel filtration, Ion exchange and Reverse phase chromatography. Spectroscopy: visible and UV spectrophotometry: theoretical aspects, instrumentation and analysis in biochemical research. Spectrofluorimetry. Outline of the radioisotopic techniques).

2nd week

Examples of Experimental design, Evaluation of Scientific Literature.
Models in biological research.
Cell cultures methods; culture media; cell sorting and analysis; cell counts and cryogenic storage; flow cytometry, FACS and MACS. Application of labelled compounds in biology. Protein purification techniques: magnetic beads, affinity chromatography for immobilized metal ions, IMAC.

3rd week

Principles of electrophoresis: migration of a biomolecule in an electric field. Native electrophoresis; SDS-PAGE; Electrophoresis of nucleic acids. Isoelectric focusing. 2D_SDS-PAGE. Capillary electrophoresis. Colorimetric and immunological detection methods (Western Blotting).

4th week

Immunochemistry: principles of the antigen-antibody interaction. Immunoenzymatic techniques (ELISA, EMIT, CEDIA): direct, indirect, sandwich ELISA. ELISA to quantify Ag and Ab in biological samples. Techniques to study the ligand-receptor binding.

5th week.

DNA and RNA manipulation techniques: nucleic acids extraction; Electrophoretic separation of DNA and RNA; Southern and Northen blotting (blotting techniques).

6th week

Hybridization Probe Design, Production and Applications; Electrophoretic mobility shift Assay (EMSA); Immunoprecipitation (Co-IP; ChIP; X-ChIP); Microarrays.

7th week

DNA synthesis and sequencing; Restriction enzymes; Cloning vectors; prokaryotic and eukaryotic expression vectors; Protein production in prokaryotes and eukaryotes (examples of recombinant proteins in therapy).

8th week

PCR principles; PCR end-point; RT-PCR; RealTime PCR; in vivo and in vitro mutagenesis; PCR in site-directed mutagenesis, in diagnostics and in personalized medicine.

9th week

Process of genetic modification: genetically modified organisms (GMOs, mouse models in clinic). MicroRNA; Interference with RNA and SiRNA (therapeutic use). Genome modification (Crispr / CAS system) and therapeutic application of the mentioned techniques. Outlines on Stem Cells.

10th week

Production of recombinant vaccines and humanised antibodies. Use of recombinant viruses or antibodies in therapy (e.g. anti-tumour).

11th week

Enzymatic purification: principles and quantification (kinetics, regulation and inhibition). Enzyme immobilization, kinetics of immobilized enzymes, Biosensors (diagnostic use).

12th week.

Clinical enzymology: enzymes in diagnostics (enzymes as diagnostic tools); enzymopathies; genetic enzymopathies and outline of Enzyme replacement therapy and Enzyme therapies (e.g. in cancer).

Suggested textbooks