Tecniche cromatografiche avanzate

Basi teoriche della cromatografia liquida: fattore di ritenzione, fattore di selettività, risoluzione, numero di piatti teorici, meccanismi di separazione.

Materiali: colonne capillari, micro-impaccamenti silicei, materiali ibridi organico-silicei, impaccamenti monolitici.

Separazioni cromatografiche stereoselettive: principi teorici e fasi stazionarie chirali innovative. Farmaci chirali ("Chiral drugs"): dalla talidomide ai farmaci approvati dalla FDA nel 2015. La pratica del "chiral switch" come strategia di drug discovery. Concetto dell'inversione dell'ordine di eluizione di enantiomeri. 

Cromatografia a interazione idrofilica (Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC): immobilizzazione di zuccheri mediante l'approccio della click-chemistry. Analisi cromatografica di zuccheri: concetto della interconversione "on-column" (anomerizzazione).

Trasferimento di metodi dalla HPLC (High Performance Liquid Chromatography) alla UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography).

Colonne capillari monolitiche e loro applicazioni nel campo della proteomica. Analisi di proteine istoniche e delle loro modificazioni post-traduzionali (PTM): acetilazione ed enzimi coinvolti (istone acetiltransferasi, HAT e istone deacetilasi, HDAC). Screening di potenziali farmaci inibitori di HDAC mediante l'approccio delle colonne monolitiche capillari.

Spettrometria di massa

Introduzione alla spettrometria di massa (MS). Definizioni. Sorgenti di ionizzazione: impatto elettronico (EI), ionizzazione chimica (CI), ionizzazione per elettronebulizzazione (ESI), ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI), ionizzazione per desorbimento da laser assistita da matrice (MALDI).

Analizzatori: quadrupolo, tempo di volo, trappola ionica. Ionizzazione a pressione atmosferica (API).

ESI: fattori che influenzano la nebulizzazione. Voltaggio del capillare, tensione superficiale del solvente. Flusso del solvente. Conducibilità e forza ionica del solvente. Disegno della sorgente. Capillare, sampling cone, geometrie on- e off-axis, z-spray, auxiliary e sheath gas. Accoppiamento HPLC-ESI-MS: diretto e con splitting. Scelta del sistema HPLC da accoppiare alla ESI. Compatibilità con solventi e additivi. Requisiti strutturali degli analiti. Effetto del modificatore organico. Effetto del pH dell’eluente. Effetto del tampone. Agenti di coppia ionica in ESI. Cationizzazione. Addizioni post-colonna. Effetto dell'acido trifluoroacetico e sua neutralizzazione.

APCI: disegno della sorgente, corona discharge, compatibilità e campo di applicazione. Complementarità con la tecnica ESI. Scelta del sistema HPLC da accoppiare alla APCI. Compatibilità con solventi e additivi. Agenti di coppia ionica in APCI. Requisiti strutturali degli analiti.

Termini e definizioni: rapporto massa/carica; ioni multi-carica; ione molecolare e picco base; risoluzione di massa; intervallo di massa. Massa nominale, massa monoisotopica, massa più abbondante, massa media nello spettro di massa di una proteina.

Spettrometria di massa tandem (MS/MS). Triplo quadrupolo. Modalità di scansione in massa tandem: (1) scansione dello ione prodotto; (2) scansione dello ione precursore; (3) scansione di perdita neutra; (4) monitoraggio di reazione selezionata (SRM). Dissociazione indotta da collisione (CID).

Studi di ricognizione molecolare stereoselettiva in fase gassosa. Lo spettrometro di massa come reattore. Orbitrap. Complessi host-guest e loro frammentazione.