Indice degli argomenti
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-Obiettivi generali
Scopo di questo corso è di fornire le conoscenze delle tecniche sperimentali molecolari, al fine di consentire un approccio e un'analisi critica delle sperimentazioni genetico-molecolari. Verranno descritti i principi e le tecniche di manipolazione genetica, sia nella ricerca di base che nell’ambito delle loro applicazioni biomediche e agronomiche. Verranno affrontate sia le tecniche di base della manipolazione di acidi nucleici e proteine, fino a quelle di ultima generazione per studi di tipo molecolari su larga scala. Inoltre verranno presentati e discussi articoli scientifici con esempi reali di utilizzo di queste tecniche, aggiornati ogni anno. Verranno discussi anche i progressi più recenti nel campo e le implicazioni etiche di queste ricerche.
Programma
Tecniche molecolari di base: enzimi di restrizione/modificazione, tecnica dei linkers e adattatori, marcatura del DNA, Southern, Northern, Western blot. Reazione a catena della polimerasi (PCR), Real time e sue applicazioni. Sequenziamento del DNA: sequenziamento manuale (Maxam & Gilbert; Sanger) e sequenziamento automatico. NGS e sue applicazioni. Tecniche di clonaggio: tradizionale, tecnologia Gateway e Golden. Trasformazione di cellule pro/eucariotiche. Librerie genomiche e a cDNA. Strategie di screening. Analisi d’espressione: Northern blot, RT-PCR semi quantitativa e competitiva, qRT-PCR, RNA-seq. Microarray e la tecnologia Affymetrix. Geni reporter, analisi di promotori. Espressione eterologa in E.coli e S.cerevisiae e in cellule eucariotiche superiori. Interazione DNA-proteine: One-hybrid, EMSA, footprinting, South-western, Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). ChIP-on-chip. ChIP-seq. Interazione RNA-proteine: RNA pull-down, RIP, CLIP. Interazione proteina-proteina: two, three, four-hybrid, co-immunoprecipitazione (Co-ip), pull-down. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Fluorescence resonance energy transfer (FRET), Split-ubiquitin.Tipizzazione del DNA, Marcatori genetici (VNTR, STR, SNP). "Chromosome walking", DNA Fingerprinting. Trasformazione di cellule/organismi animali. Clonazione: dalla pecora Dolly ai macachi ZZ e HH. Trasformazione di cellule/organismi vegetali. Organismi Geneticamente Modificati (OGM). Strategie per studiare la funzione di un gene: genetica Forward e Reverse. RNA interference: principi di base e applicazioni. Targeting-induced local lesions in genomes (TILLING). Editing genomico: dal Talen al Crisp-Cas9. Synthetic biology. Biosensori ed applicazioni. Optogenetics.
Genetic engineering basic Tecniques: restriction/modification enzymes, linkers, adapters. DNA probes, Southern, Northern, Western blot. Polymerase chain reaction (PCR), Real time and applications. DNA sequencing: manual and automatic sequencing. Next Generation Sequencing (NGS) and applications. Cloning tecniques: traditional cloning, Gateway and Golden technologies. Transformation of pro/eukaryotic cells. Genomic and cDNA lybraries. Screening Strategies. Expression analysis: Northern blot, semi-quantitative and competitive RT-PCR, qRT-PCR, RNA-seq. Microarray and Affymetrix technologies. Reporter genes, promoter analysis. Heterologous expression in E.coli, S.cerevisiae and in eukaryotic cells. DNA-proteins interaction: one-hybrid, south western, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), footprinting, Chromatin Immuno Precipitation (ChIP). ChIP-on-chip. ChIP-seq. RNA-proteins interaction: RNA pull-down, RIP, CLIP. Protein-protein interactions: yeast two, three, four-hybrid, co-immunoprecipitation (co-ip), pull down assays. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Fluorescence resonance energy transfer (FRET), Split-ubiquitin. DNA fingerprinting, genetic markers (VNTR, STR, SNP)."Chromosome walking". Animal cells transformation. Animal cloning: from Dolly to Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT). Plant transformation, plant genetic engineering. Genetic Modified Organisms (GMO). Strategies to study gene function: forward and reverse genetics. RNA interference and applications. Targeting-induced local lesions in genomes (TILLING). Genome editing: from Talen to Crisp-Cas9. Synthetic biology. Biosensors and applications. Optogenetics.
Terry A. Brown Biotecnologie Molecolari. Ed. Zanichelli. 2° ed.italiana. Libro multimediale.
Zlatanova J. and van Holde K.E. Biologia molecolare (cap. 5 e tecniche nei diversi capitoli).
Ricevimento
Lunedì h10/11. Gradita prenotazione via email paola.vittorioso@uniroma1.it
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